经验者之家｜养生修身：荧光检查是怎么检查的 荧光检测的特点……

一、荧光检测的检测方法

流式

优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全不用担心荧光淬灭的问题。缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。

荧光显微镜

刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。

共聚焦

荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。另外，4Pi和STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。

全内反射

荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且最适合做膜研究，无法看到胞内信息。也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。

双光子

另一种共聚焦，因使用长波激发荧光，故能做深层检测（突破共聚焦的100微米极限），最典型的应用是观察*脑组织。巨贵无比，国内没有几台，能用上的人不多——就不说了。

高内涵药筛系统

流式和显微镜的杂合体，使用电动载物台，可以自动地按预定程序完成实验，可做大流量检测（虽然速度慢点），而且有成像能力，可以判断定位。前段时间，国内哪装了第一台，很多人在吹，但我实在不知道其中的好处——任何一台带电动载物台的显微镜都可以达到相似的效果。

二、荧光检测有哪些特点

荧光定量：采用国际主流的荧光定量PCR技术，迅速提升技术水平。

结果稳定：检测结果CV值与进口全自动PCR仪接近，具有自检功能，避免错误数据的输出。

封闭操作：全部检测过程均为闭管操作，于反应管处检测荧光，有效防止污染，解决PCR技术中最棘手之难题。

准确定量：满足临床对量化的需求，定量荡围宽，可涵盖大部分病原微生物，自动曲线拟合。

灵敏度高：利用光谱信号灵敏性的优势，有效提高检测灵敏度。

安全：全程无毒检测。

操作简便：省去后处理的烦琐过程。

直接打印：直接打印结果，无须记录大量数据。

升级版：FS1000有与电脑连接的数传输口，可以连接电脑，根据用户需要提供先进分析软件，全面分析实验数据。（电脑和打印机选配件）

故障率低：维护非常简单。

节约资源：可利用现用PCR扩增仪，最大限度节约资源。

三、荧光检查法是怎么回事

直接免疫荧光法

用以检查病人的皮肤组织中有无免疫球蛋白或补体沉积，用特异荧光抗体直接滴加于待检的标本上，由荧光标记的抗体与抗原发生特异结合。使之呈现荧光，根据荧光分布和形态确定抗原部位和性质。此法用已知的抗体检查未知的抗原，但一种标记抗体只能查一种抗原，可直接采用病人的病变组织。如：红斑狼疮、疱疹样皮炎、类天疱疮等作冰冻切片，荧光染色。此法简单、特异。

采集标本后，直接涂于载玻片上，自然干燥后，丙酮固定10分钟，待丙酮完全挥发后，加30l特异性的荧光素标记的抗体，室温湿盒内孵育30min，使标记的抗体与抗原发生特异性结合，取出后蒸溜水冲洗去未结合的抗体，置荧光显微镜下观察。

间接免疫荧光法

用以检测病人血清中是否存在某种特异抗体或自身抗体，反应中的两对抗原抗体相对应的特异结合，而第二抗体（荧光抗体）则针对第一抗体的结合体，由于第一抗原分子可与若干个抗体分子结合，因而第二结合反应后，灵敏度大大提高。本法常用于各种自身抗体的检测。如：系统性红斑狼疮、硬皮病等。

标本采后，保存于转送培养基中，临用前混匀后取悬液涂片，固定后加入50l用PH7.2PBS1:16稀释的特异性抗体，35℃孵育30分钟，取出后用PH9.0的0.01M的磷酸盐缓冲液浸泡10分钟，干燥后用50l1:500稀释的荧光抗体（第二抗体），35℃孵育30min，蒸溜水冲洗，干燥后甘油封固加盖玻片镜下观察。

补体结合法

本法是在间接法的基础上发展而成的，即在抗原抗体反应时，加入补体，再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。如：检测妊娠疱疹病人的自身抗体。

四、荧光检测器的检测原理

检测原理

化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光；

荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)之间的关系为：F=2.3QKI0εCl

F=KC

Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系数，l为光径长度。

荧光产生

从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。电子在同类分子或其他分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要长于分子吸收的紫外光波长，通常在可见光范围内。荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光。